Приложение к Приказу от 27.01.2009 г № 46 Обследование
Узо от 27 января 2009 г. №46 сбор, подготовка, транспортирование и хранение клинических образцов для диагностики краснухи и свк методом ифа, от-пцр, изоляции вируса на культуре клеток
I.Общая информация
Для выявления специфических краснушных IgM и IgG забор крови для получения сыворотки должен осуществляться в строго регламентированные сроки. Несоблюдение сроков сбора образцов сыворотки может быть причиной неправильной интерпретации результатов исследования.
В качестве клинических образцов для изоляции вируса краснухи на культуре клеток и экстракции РНК-вируса с последующим проведением ПЦР и генотипирования при подозрении на краснуху беременной и СВК используются носоглоточные соскобы и смывы. При постнатальной краснухе нецелесообразно использовать для ОТ-ПЦР и изоляции вируса образцы крови в связи с коротким периодом вирусемии.
Информация по биологической безопасности
Клинические образцы потенциально могут содержать широкое разнообразие возбудителей инфекционных заболеваний, в связи с чем все манипуляции необходимо проводить с соблюдением правил работы с инфицированными материалами. Всегда следует надевать перчатки, при работе вне бокса - использовать защитные очки.
Материалы и оборудование
Набор для забора носоглоточных соскобов (стерильный зонд - тампон в пробирке).
Вакутейнеры 5 мл для забора крови на сыворотку.
Градуированные центрифужные пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой 15 мл.
Пробирки типа "Эппендорф".
Пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой 2 мл для замораживания образцов.
Антибиотики: бензилпенициллина натриевая (калиевая) соль; стрептомицина сульфат.
Рефрижераторная центрифуга.
Особые указания
Все процедуры следует проводить в условиях максимально возможной стерильности. Работать необходимо с охлажденными до 2...8 град. С образцами, не допуская их нагревания и воздействия прямого солнечного света.
На каждый образец обязательно заполнение направления на лабораторное исследование (прилож. 4, 5).
При выявлении специфических IgM в образцах сывороток, собранных от пациентов с постнатальной краснухой в первые три дня с момента появления сыпи, можно получить ложноотрицательные результаты (до 50% образцов). В то же время вероятность выделения вируса наиболее высока при исследовании образцов, полученных в первые трое суток с момента появления сыпи. Таким образом, с одной стороны, не следует задерживать сбор образцов для вирусологических исследований, с другой - собирать сыворотку ранее 4-го дня с момента появления сыпи.
В связи с длительной циркуляцией краснушных IgM и персистенцией вируса краснухи у пациентов с СВК специфические IgM выявляются в ИФА, вирус может быть изолирован на культуре клеток и вирусная РНК детектирована в ОТ-ПЦР с высокой вероятностью положительного результата теста в течение первых 3 месяцев жизни ребенка. В дальнейшем частота положительных находок снижается, однако у некоторых пациентов специфические IgM и вирус выявляются до года после рождения.
II.Сбор, подготовка, транспортирование и хранение клинических образцов
Сбор сывороток для серологических исследований
Для выявления специфических краснушных IgM у больных краснухой, в т.ч. беременных, оптимальными сроками забора крови являются 4 - 28-е сутки с момента появления сыпи. Для выявления специфических краснушных IgG необходимо забирать два образца крови: первый - в первые дни заболевания, второй - через 10 - 14 дней. При обследовании беременной в очаге краснухи (контакт) кровь необходимо забрать в максимально ранние сроки и повторно - в зависимости от результатов исследования первой сыворотки.
При СВК наблюдается длительная циркуляция (до года после рождения) IgM в высоком титре, поэтому сроки забора крови не имеют большого значения, однако целесообразно обследовать новорожденных в первые дни жизни, при этом возможны забор и тестирование проб пуповинной крови.
Манипуляции
1.Заберите 5 мл (у детей до 5 лет - 1 мл) венозной крови в вакутейнер для получения сыворотки крови.
2.Центрифугируйте при 3000 об./мин. в течение 15 мин. для отделения сыворотки.
3.Осторожно, избегая повреждения эритроцитов, отберите сыворотку в стерильную пластиковую пробирку типа "Эппендорф".
4.Укажите на этикетке имя или идентификационный номер пациента, дату забора и тип образца.
5.Храните и транспортируйте сыворотку при 2...8 град. С, если есть возможность доставить ее в лабораторию для исследования в течение 72 ч. с момента забора, или при -20 град. С при необходимости более длительного хранения и транспортирования.
Не допускайте повторного замораживания, оттаивания сыворотки, так как это может оказать разрушающее воздействие на IgM антитела.
6.Доставьте образцы в лабораторию как можно скорее.
Взятие носоглоточных соскобов и смывов
Для изоляции вируса краснухи и экстракции РНК-вируса могут быть использованы носоглоточный смыв или соскоб, собранные не позже 5-го дня с момента появления сыпи при постнатальной краснухе и в течение 1-го года жизни ребенка при СВК.
Манипуляции
Носоглоточный смыв:
1.Предложите пациенту прополоскать горло 3 - 5 мл физиологического раствора.
2.Соберите промывные воды в стерильную пробирку.
3.Осадите клеточную фракцию путем центрифугирования при 4 град. С, 1500 об./мин. в течение 5 мин.
4.Удалите надосадочную жидкость.
5.Растворите осадок в 1 мл транспортной среды.
6.Образцы необходимо доставить в лабораторию для исследования при 2...8 град. С в течение 48 ч.
7.В случае отсутствия возможности для доставки образцов в указанные сроки заморозьте их и храните при температуре не выше -70 град. С.
Носоглоточный соскоб:
1.Стерильным ватным тампоном с усилием (чтобы собрать достаточное количество клеток) протрите слизистую оболочку носоглотки пациента.
2.Тампон поместите в стерильную 15 мл пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащую 3 мл транспортной среды.
3.Образец необходимо доставить в лабораторию для исследования при 2...8 град. С в течение 48 ч.
4.В случае отсутствия возможности доставки образца в указанные сроки пробирку с тампоном энергично встряхните, чтобы смыть клетки, и извлеките тампон.
5.Осадите клеточную фракцию путем центрифугирования при 4 град. С, 1500 об./мин. в течение 5 мин.
6.Удалите надосадочную жидкость.
7.Растворите осадок в 1 мл транспортной среды.
8.Заморозьте и храните образцы при температуре не выше -70 град. С.
Носоглоточный соскоб может быть забран с использованием наборов для сбора образцов для вирусологических исследований. В этом случае образец забирается в соответствии с рекомендациями производителя набора. В качестве примера приведена процедура забора носоглоточного соскоба с использованием набора "VIROCULT".
1.Стерильным ватным тампоном с усилием (чтобы собрать достаточное количество клеток) протрите слизистую оболочку носоглотки пациента.
2.Поместите тампон в пробирку, сожмите дно пробирки, чтобы выделившаяся транспортная среда смочила тампон.
3.Образец необходимо доставить в лабораторию для исследования при 2...8 град. С в течение 48 ч.
4.В случае отсутствия возможности для доставки образца в указанные сроки добавьте в пробирку 2 мл транспортной среды для выделения вирусов, пробирку с тампоном энергично встряхните, чтобы смыть клетки, и извлеките тампон, предварительно отжав его о стенку пробирки.
5.Перенесите жидкость в отдельную стерильную пробирку типа "Эппендорф" или пластиковую пробирку с завинчивающейся крышкой для замораживания образцов.
6.Заморозьте и храните образцы при температуре не выше -70 град. С.
Примечание: не используйте наборы для сбора образцов для бактериологических исследований и наборы с истекшим сроком годности.
III.Транспортирование образцов
Сыворотку транспортируйте при 2...8 град. С, если есть возможность доставить ее в лабораторию для исследования в течение 72 ч. с момента забора, или при -20 град. С при необходимости более длительного хранения и транспортирования.
Замороженный носоглоточный смыв (соскоб) необходимо доставить в лабораторию для исследования как можно скорее при -70 град. С (сухой лед). При отсутствии такой возможности допускается кратковременное хранение и транспортирование (до лаборатории, осуществляющей тестирование) при -20 град. С. Следует учитывать, что эта температура не является оптимальной для хранения и транспортирования клинических образцов для вирусологических исследований на вирус краснухи.
Собранные образцы необходимо поместить в отдельные пластиковые пакеты с замком с небольшим количеством ваты для адсорбции влаги. Нельзя упаковывать клинические образцы от разных людей в один пакет. Несколько клинических образцов от одного пациента могут быть упакованы в один пакет большего размера.
Для транспортирования образцов можно использовать термоконтейнеры, термосы или пенопластовые коробки с хладоэлементами. Образцы надо расположить так, чтобы они со всех сторон были окружены замороженным (охлажденным до 2...8 град. С) хладоэлементом (можно использовать лед в герметичных пластиковых пакетах или бутылках).
Образцы для выделения вируса и экстракции РНК можно транспортировать при температуре 2...8 град. С (не более 48 ч. с момента забора), используя хладоэлементы, охлажденные до соответствующей температуры, или в замороженном состоянии (-70 град. С в сухом льду в герметичных укупорках во избежание воздействия на образцы углекислоты).
Под крышку контейнера поместите сопроводительные документы (письмо с указанием вида и количества образцов, времени и даты отправки, направление на исследование).
На контейнере обязательно укажите подробные координаты отправителя и получателя образцов, а также необходимые предупреждающие надписи. Может оказаться полезным сделать следующую надпись: "Хранить в холодильнике".
При одновременной отправке замороженных и хранящихся при 2...8 град. С образцов используйте отдельные контейнеры с хладоэлементами, обеспечивающими соответствующий температурный режим.
IV.Транспортная среда для выделения вирусов
Состав:
- основной раствор Хенкса рН 7,4 с ХЕПЕС буфером;
- бычий сывороточный альбумин;
- раствор антибиотиков;
- 0,4-процентный раствор фенолового красного.
Растворите 2,0 г бычьего сывороточного альбумина в 100 мл дистиллированной воды. Добавьте к 80 мл дистиллированной воды 10 мл раствора Хенкса, затем добавьте 10 мл 0,2-процентного раствора бычьего сывороточного альбумина (см. выше) и 0,2 мл раствора фенолового красного. Стерилизуйте фильтрованием. Добавьте 1 мл раствора антибиотиков.
Раствор антибиотиков:
6
Растворите 10 ЕД пенициллина и 1,0 г стрептомицина в 100 мл
стерильного фосфатного буферного раствора. Разлейте во флаконы по 5 мл и
храните при -20 град. С. Добавление 1 мл этого раствора к 100 мл
питательной среды позволяет получить рабочий раствор с окончательной
концентрацией 100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина в 1 мл раствора.Примечание: при отсутствии транспортной среды можно использовать питательную среду для культур клеток (RPMI, ИГЛА и др.)